สไปเดอร์แมน (โทบี้ แม็กไกวร์) ปีเตอร์ พารค์เกอร์ ได้รับพลังของแมงมุมที่ถูกกัดแล้วเขาก็พบว่าสิ่งที่เขาเป็นคือการรับผิดชอบที่จะต้องช่วยเหลือเพื่อนมนุษย์กับพลังที่ใหญ่ยิ่ง ตั้งแต่ลุงเบนเสียชีวิตไปในอุบัติเหตุที่มาจากจอมวายร้ายมนุษย์ทรายที่สไปเดอร์แมนออกตามล่า เขาจึงก้าวเข้าสู่เส้นทางในการกำจัดอาชญากรอย่างเต็มไปตัวในระหว่างเดียวกัน สไปเดอร์แมน ก็ต้องรักษาบทบาทการเป็นเพื่อนที่ดีของ แฮร์รี่ ออสบอร์น (เจมส์ ฟรังโก) และแฟนสาวของสไปเดอร์แมน แมรี่เจน วัตสัน (คริสเตน ดันสต์) เมื่อพวกเขาได้ย้ายไปทำงานในสถานที่แห่งใหม่ แต่ศัตรูตัวร้ายที่ขโฒยอาวุธเทคโนโลยีของออสคอร์ปมาใช้คือกรีนก็อบลิน (วิลเลียม ดาโฟ) ที่เริ่มเข้าใกล้ตัวจริงภายใต้หน้ากากของสไปเดอร์แมนว่าเป็นใครกันแน่