ปีเตอร์ พารค์เกอร์ (โทบี้ แม็กไกวร์) ได้แยกย้ายไปทำวิจัยกับวิชาเรียนในหลักสูตรเขากับ อ็อตโต อ็อกตาเวียส (อัลเฟรด โมลินา) อาจารย์ที่กำลังได้รับทุนด้านงานวิจัยที่ก้าวหน้ามากที่สุดในสถาบัน โดยที่เขาสามารถสร้างดวงอาทิตย์เทีมได้เป็นคนแรกของโลก แต่งานวิจัยอันทรงคุณค่านี้ได้ชักจูงความเลวร้ายถึงขีดสุดจากตัวตนของเขาออกมาด้วยสิ่งประดิษฐ์ที่เชื่อมต่อกับระบบประสาทและกำลังควบคุม อ็อกตาเวียส สู่ด้านมืดในการทำลายล้างเมืองเพื่อแสดงศักยภาพของดวงอาทิตย์ปลอม ปีเตอร์ ก็กำลังถูกบังคับให้เปิดเผยตัวจริงว่าเขาคือสไปเดอร์แมนและคนที่ฆ่าพ่อของ แฮร์รี่ ออสบอร์น (เจมส์ ฟรังโก) ในส่วนของ แมรี่เจน วัตสัน (คริสเตน ดันสต์) ก็ตกเป็นตัวประกันของอ็อกตาเวียส