นาตาชา โรมานอฟ (สการ์เล็ต โจแฮนสัน) เริ่มเข้าใจที่มาและความหมายที่เธอมีชีวิตอยู่มาจนถึงทุกวันนี้กับการฝึกเป็นสายลับด้วยเทคโนโลยีทางทหารของรัสเซีย ขณะที่เธอกลับไปที่บ้านเกิดก้ได้เจอกับ เยเลนา เบโลวา (ฟลอเรนซ์ พิวจ์) น้องสาวที่ยังรับภารกิจให้กับแบล็ค วิโดว์ และเธอต้องการจะถอนตัวออกจากปฎิบัติการขององค์กรที่ซับซ้อนและถูกคุกคามให้ทำตามคำสั่งที่แตกต่างออกไปในการฆ่าผู้บิสุทธิ์ ในระหว่างนั้นยอดมนุษย์ ธันเดอร์โบว์ (เดวิด ฮาร์เบอร์) คือผู้ที่คอยสนับสนุนการต่อสู้และแผนบุกโจมตีของ นาตาชา ในฐานทัพของแบล็ค วิโดว์ ที่กำลังใช้มนุษย์โคลนที่ถูกตั้งโปรแกรมให้มีกำลังทำลายล้างสูง