ปีเตอร์ ปาร์คเกอร์ (แอนดรูว์ การ์ฟิลด์) ในขณะที่เขาเป็นนักศึกษาฝีกงานที่บริษัทวิจัยทางด้านวิทยาศาสตร์ที่พ่อของเขาเคยร่วมงานให้ก่อนจะหายตัวไป แมงมุมสายพันธ์พิเศษที่ถูกดัดแปลงพันธุกรรม เขาได้รับพลังความสามารถของแมงมุมให้เป็นมนุษย์กลายพันธ์ในยามที่วิกฤติ แล้วการผจญภัยเพื่อปกป้องเมืองจากแผนการร้ายของศัตรูลึกลับที่มีลักษณะคล้ายสัตว์เลื้อยคลานก็กำลังหาทำลายล้างเมือง ในขณะที่เขาเข้าใกล้ความลับอีกด้านในห้องทดลองแมงมุมของพ่อที่ถูกซ่อนเอาไว้ที่สถานีรถไฟชั้นใต้ดิน เกว็น สเตซี่ (เอ็มม่า สโตน) จึงเป็นเพื่อนนักศึกษาของเขาที่เข้าใจเรื่องราวที่ผ่านมาและผลการทดลองที่มีความเสี่ยงถูกกักเก็บเอาไว้ที่บริษัทของเธอ